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造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新和分化为所有下游血细胞的能力，在整个生命周期中不断为机体提供新鲜血液。在衰老过程中，HSC会发生髓系分化偏好、淋系分化减少、造血重建能力受损和克隆性造血等一系列变化，最终可能诱发免疫力低下、贫血或白血病等血液疾病，目前仍然缺乏有效逆转HSC衰老的方法。HSC的稳态维持和衰老与其所定位的骨髓微环境密切相关，其中LepR+骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）不仅可以分泌Scf和Cxcl12等因子维持HSC自我更新，而且富集骨骼干细胞从而调控成体骨骼稳态和损伤修复。骨髓微环境在衰老过程中会发生骨质疏松、脂肪积累、血管退变、神经与血管周细胞减少等现象，然而人们对于衰老骨髓的生物物理特性改变却知之甚少。此外，能否通过改变骨髓微环境逆转HSC衰老仍然存在争议。

2023年4月6日，同济大学生命科学与技术学院、附属东方医院再生医学研究所岳锐课题组在Cell Stem Cell期刊发表了题为：Harnessing matrix stiffness to engineer a bone marrow niche for hematopoietic stem cell rejuvenation的研究论文，并获同期评述（Preview）。

该研究发现基质硬度密切调控骨髓造血微环境，并利用柔软的甲基丙烯酰化水凝胶（GelMA）构建了BMSC与HSC的体外3D共培养体系。该系统不仅可以促进HSC自我更新和淋系分化，而且能够显著逆转衰老HSC的各项功能指标。

此外，该研究还揭示了骨髓硬化是血液系统衰老的新型标志物。这一重要研究成果为衰老HSC年轻化以及衰老相关疾病治疗提供了新思路和新策略。

研究人员首先利用流变仪测量了年轻小鼠骨髓块的硬度，发现其相当柔软（约为200Pa）。随后，他们利用荧光报告小鼠（ScfGFP；Cxcl12DsRed）发现BMSC在体外进行2D培养时Scf和Cxcl12表达显著下调，而将其转移到柔软的5% GelMA水凝胶（硬度与年轻小鼠骨髓相仿）中进行3D培养时，细胞形态与Scf和Cxcl12表达得到明显恢复。研究者对原代（未经培养）、2D和3D培养的BMSC进行了RNA-seq和ATAC-seq分析，发现3D培养后的BMSC状态介乎于原代和2D培养之间。与原代和3D培养的BMSC相比，2D培养的BMSC细胞周期明显加快，Hippo以及RhoA信号通路相关基因显著上调。ATAC-seq分析表明Yap/Taz下游的转录因子Tead2/Tead4 结合位点在2D培养的BMSC中显著开放。与之相符，2D培养的BMSC中Yap/Taz主要定位于核内，而原代及3D培养的BMSCs中Yap/Taz主要定位于核外或呈均匀分布。F-actin染色及G-LISA实验结果显示位于Yap/Taz上游的RhoA/ROCK信号通路在2D培养的BMSCs中激活，而在3D培养后被显著抑制。最后，研究人员通过敲除Yap/Taz或者过表达组成型激活的Yap（YAP-5SA），证明Yap/Taz能通过感知基质硬度改变从而调节BMSC增殖状态和HSC维持因子表达。Yap/Taz感受硬度变化并调控BMSC增殖与HSC维持因子表达接下来，研究者通过对培养基成分和GelMA硬度的筛选优化，构建了BMSC与HSC体外3D共培养系统。他们发现与BMSC在柔软的5% GelMA中进行3D共培养能够促使HSC产生更多的造血干祖细胞。竞争性移植实验也证明柔软的5% GelMA比更硬的10% GelMA培养条件，以及相同数量未经培养的原代HSC具有更强的多谱系重建能力，尤其是淋系重建能力。由于衰老HSC的淋系分化能力明显减弱，因此研究者随即尝试利用该系统逆转HSC衰老。他们首先对原代年轻（2月龄）和中年（12月龄）HSC，以及3D共培养后的年轻和中年HSC进行了RNA-seq分析，发现淋系分化相关基因在3D共培养后（年轻和中年）的HSC中显著富集。与之相反，衰老相关基因则在3D共培养后的中年HSC中发生扭转。研究者通过对HSC线粒体膜电位和Cdc42/Tubulin极性分布分析发现，3D共培养可显著逆转HSC衰老标志物。此外，他们还通过竞争性移植实验证明3D共培养后的年轻和中年HSC的造血重建能力显著高于原代HSC，尤其是其淋系分化能力。更为重要的是，二次移植实验发现3D共培养后的年轻和中年HSC表现出与原代年轻HSC完全相同的多谱系长时程造血重建能力。研究者还分析了年老（24月龄）HSC的年轻化效果，并利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和移植实验对3D共培养后的淋系祖细胞（CLP）和HSC进行了深入分析，从而证明3D共培养可以促进CLP分化并有效逆转HSC衰老。

与BMSC进行体外3D共培养促进衰老HSC年轻化

scRNA-seq分析与纯化后HSC移植

以上结果提示骨髓基质硬度可能密切调控HSC衰老。为了验证这一假设，研究者利用原子力显微镜对年轻、中年及年老小鼠长骨骨髓进行了原位测量，发现小鼠骨髓基质硬度随年龄的增长显著增加。他们通过对不同年龄段BMSC的scRNA-seq数据进行分析发现，Scf和Cxcl12表达伴随骨髓硬化显著下调，RhoA信号通路被显著激活。研究者还发现与年轻BMSC相比，年老BMSC中Yap/Taz核外分布的细胞比例减少，核内分布的细胞比例明显增加。以上数据表明衰老小鼠骨髓硬度增加，BMSC中Yap/Taz信号通路被激活，这可能与HSC维持因子下降和HSC衰老密切相关。

衰老伴随骨髓硬化和造血维持能力下降

综上所述，该研究揭示了基质硬度在调控骨髓造血微环境中的关键作用，并应用该原理在体外成功构建了柔软的年轻骨髓微环境用于HSC的维持和年轻化。此外，该研究还发现骨髓硬化是造血系统衰老的重要标志物。这一研究成果表明通过改变骨髓微环境逆转HSC衰老是一种行之有效的方法，从而为改善HSC质量、逆转机体系统性衰老和治疗重大血液疾病提供了创新策略。

该研究工作由同济大学岳锐教授指导完成，主要合作者包括华东理工大学王靖教授、中国科学院应用物理研究所王丽华研究员、同济大学高绍荣教授、高亚威教授和王启刚教授。同济大学研究生张潇颖、曹丹丹、徐丽婷和许艳华为论文共同第一作者。该研究获得了科技部国家重点研发计划，基金委面上和重大培育项目的大力支持。